Immunofluorescence Microscopy Technique and Theory Imunofluorescenční mikroskopie Technika a teorie

Immunofluorescence Microscopy Imunofluorescenční mikroskopie

Learn About Immunofluorescence Microscopy Získejte informace o imunofluorescenční mikroskopie

Antibodies bind stably and specifically to their corresponding antigen, they are invaluable as probes for identifying a particular molecule in cells, tissues, or tissues, or biological fluids. Antibody molecules can be used to locate their target molecules accurately in single cells or in tissue sections by a variety of different labeling techniques. When the antibody itself, or the antiimmunoglobulin antibody used to detect it is labeled with a fluorescent dye the technique is known as immunoflurescence microscopy. As in all serological techniques, the antibody binds stably to its antigen, allowing unbound antibody to be removed by thorough washing. As antibodies to proteins recognize the surface features of the native, folded protein the native structure of the protein being sought usually needs to be preserved, either by using frozen tissue sections that are fixed only after the antibody reaction has been performed. Some antibodies, however, bind proteins even if they are denatured, and such antibodies will bind specifically even to protein in fixed tissue sections. Protilátky váží stabilně a zvlášť na jejich odpovídající antigen, jsou neocenitelné jako sondy pro identifikaci konkrétní molekuly v buňkách, tkáních nebo tkáně, nebo biologických tekutin. Antibody molekuly může být použit k nalezení jejich cílových molekul přesně v jediné buňky či tkáně v sekcích celá řada různých označení technik. Když protilátka sama, nebo antiimmunoglobulin protilátky použity ke zjištění, že je s označenou fluorescenčním barvivem technika je známá jako immunoflurescence mikroskopie. Jako ve všech sérologických metod, protilátky se váže na své stabilně antigen, umožňující nevázaného protilátky, které mají být odstraněny důkladné mytí. protilátky na bílkoviny Jak rozpoznat povrchu rysy původní, skládací bílkovin nativní struktury proteinu, je požadován obvykle musí být zachován, a to buď pomocí zmrazené tkáně sekcí, které jsou stanoveny až poté, co se protilátky Reakce byla provedena. Některé protilátky se však váží proteiny, i když jsou denaturované, a tyto protilátky se váží specificky i na bílkoviny v pevných tkáňové řezy.

The fluorescent dye can be covalently attached directly to the specific antibody, but more commonly, the bound antibody is detected by fluorescent anti-immunoglobulin, a technique known as indirect immunofluorescence. The dyes chosen for immunofluroscence are exited by light of one wavelength, usually blue or green, and emit light of a different wavelength in the visible spectrum. The most common fluorescent dyes are fluorescein, which emitsgreen light, Texas Red and Peridinn chlorophyll protein (PerCP), which emit red light, and rhodamine and phycoerythrin (PE) which emit orange/red light. By using selective filters, only the light coming from the dye or flurochrome used is detected in the fluorescence microscope. This technique can be used to detect the distribution of any protein. By attaching different dyes to different antibodies, the distribution of two or more molecules can be determined in the same cell or tissue section. Fluorescenčním barvivem může být kovalentně připojena přímo na specifické protilátky, ale častěji se váže protilátka je detekováno fluorescenční anti-imunoglobulin, technika, známá jako nepřímý imunofluorescenční. Barviv vybrat pro immunofluroscence jsou odešlo světlem jedné vlnové délky, obvykle modrá nebo zelené, a emitovat světlo na různých vlnových délek ve viditelné části spektra. Nejběžnější jsou fluorescenční barviva fluorescein, který emitsgreen světlo, Texas Red Peridinn chlorofylu a bílkovin (PerCP), které emitují červené světlo, a rhodaminu a fykoerytrinu (PE), které emitovat oranžovo-červené světlo. Použitím selektivní filtry, pouze světlo, přicházející z barviva nebo flurochrome použita zjištěna u fluorescenčního mikroskopu. Tato technika může být použita ke zjištění distribuce jakéhokoli proteinu. připojením různých barev pro různé protilátky, je rozdělení na dvě nebo více molekul mohou být stanoveny ve stejné buněčné či tkáňové části.

The recent development of the confocal fluorescent microscope, which uses computer-aided techniques to produce an ultrathin optical section of a cell or tissue, gives very high resolution immunofluorescence microscopy without the need for elaborate sample preparation. The resolution of the confocal microscope can be further increased using low-intensity illumination so that two photons are required to excite the flurochrome. A pulsed laser beam is used, and only when it is focused into the focal plane of the microscopeis the intensity sufficient to excite fluorescence. In this way the fluorescence emission itself can be restricted to the optical section. Nedávný vývoj na konfokální fluorescenční mikroskop, který používá počítač-pomocí technik, aby vypracoval ultrathin optické části buňky nebo tkáně, poskytuje velmi vysokým rozlišením, imunofluorescenční mikroskopie, aniž by bylo nutné vypracovat pro přípravu vzorků. Usnesení z konfokálního mikroskopu lze dále zvýšil na nízkoemisní-intenzita osvětlení tak, že dva fotony jsou povinny podněcovat na flurochrome. V pulsní laserový paprsek se používá, a to pouze v případě, kdy je zaměřen na ohniskovou rovinou a microscopeis intenzitou dostatečnou k podnítit fluorescence. Tímto způsobem fluorescenční emise sama o sobě může být omezena na optické části.

One important development in the area of microscopy has been the use of time-lapse video microscopy, in which sensitive digital video cameras record the movement of fluorescently labeled molecules in cell membranes and their redistribution when cells come into contact with each other. Cell-surface molecules can be fluorescently labeled in two main ways. One is by the binding of flurochrome-labeled Fab fragments of antibodies specific for the protein of intrest; the other is by generating a fusion protein, in which the protein of intrest has been attached to one of a family of florescent proteins obtained from jellyfish like GFP. The list of available fluorescent labels now includes red, blue, cyan or yellw fluorescent proteins. Jeden významný rozvoj v oblasti mikroskopie bylo využití času zanikla-video mikroskopie, v nichž citlivé digitální videokamery záznam pohybu fluorescenčně označené molekul v buněčné membrány a jejich přerozdělování, kdy buňky přijdou do styku s sebou. Cell-plocha molekul mohou být fluorescenčně označené dvěma hlavními způsoby. Jedna se o vazbu flurochrome-označeném jako Fab fragmenty specifických protilátek na bílkoviny z úroků, ostatní je dosáhnout syntézy bílkovin, v níž bílkoviny zájmu byla připojena k jednomu ze skupiny, na fluoreskující proteiny získané z medúza, jako GFP. seznamu dostupných fluorescentní etikety nyní obsahuje červená, modrá, modrozelená nebo yellw fluoreskující proteiny.