Technique et théorie de radioimmunoanalyse d'ELISA

Radioimmunoanalyses d'ELISA

Radioimmunoanalyse (RIA), et analyse enzyme-jointe d'immunosorbant (ELISA), et analyse concurrentielle d'inhibition.

La radioimmunoanalyse (RIA) et l'analyse enzyme-jointe d'immunosorbant (ELISA) sont des analyses obligatoires directes pour l'anticorps ou l'antigène et toutes deux travaillent au même principe, mais les moyens de détecter l'attache spécifique est différent. Des radioimmunoanalyses sont généralement employées pour mesurer les niveaux des hormones en sang et fluides de tissu, alors que des analyses d'ELISA sont fréquemment utilisées dans le diagnostic viral. Pour ces deux méthodes on a besoin d'une préparation pure d'un antigène connu ou anticorps, ou toutes les deux, afin de normaliser l'analyse. Cette analyse sera décrite avec un échantillon d'anticorps pur, mais le principe est semblable si l'antigène pur est utilisé à la place. Dans RIA pour un antigène, l'anticorps pur contre cet antigène est radioactivement étiqueté, habituellement avec 125I ; pour l'ELISA, une enzyme est jointe chimiquement à l'anticorps. Le composant non étiqueté, qui dans ce cas-ci serait antigène, est attaché à un support plein, tel que les puits d'un plat en plastique de multipuits, qui absorbera une certaine quantité de n'importe quelle protéine.

On permet à l'l'anticorps étiqueté de lier à l'antigène non étiqueté, dans des conditions où l'absorption non spécifique est bloquée, et n'importe quel anticorps non lié et d'autres protéines sont enlevés.

L'anticorps liant à RIA est mesuré directement en termes de quantité de radioactivité maintenue par les puits enduits, tandis que dans Elisa, liant est détecté par une réaction qui convertit un substrat sans couleur en produit coloré de réaction. Le changement de couleur peut être lu directement du plateau de réaction, rendant la collecte de données très facile, et ELISA évite également les risques de la radioactivité. Ceci fait à ELISA la méthode préférée pour plus des analyses obligatoires directes.

Des anticorps étiquetés d'anti-immunoglobuline peuvent également être employés dans RIA ou ELISA pour détecter la liaison de l'anticorps non étiqueté aux plats antigène-enduits non étiquetés. Dans ce cas-ci, l'anticorps étiqueté d'anti-immunoglobuline est utilisé dans ce qui se nomme ‘une deuxième couche’. L'utilisation d'une deuxième couche amplifie également le signal, car au moins deux molécules de l'anticorps étiqueté d'anti-immunoglobin peuvent lier à chaque anticorps non étiqueté. RIA et ELISA peuvent également être effectués avec de l'anticorps non étiqueté coincé sur les plats et l'antigène étiqueté ajoutés.

Figure : Le principe de l'enzyme a joint l'analyse d'immunosorbant (ELISA)

elisa

Pour détecter l'antigène A, le détail épuré d'anticorps pour l'antigène A est joint chimiquement à une enzyme. Les échantillons à tester sont enduits sur la surface des puits en plastique auxquels ils lient nonspecifically. Des sites collants résiduels sur le plastique sont bloqués en ajoutant les protéines non pertinentes (non montrées). L'anticorps étiqueté est alors ajouté aux puits dans des conditions où attache non spécifique