Immunofluorescence Microscopy Technique and Theory Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी तकनीक और सिद्धांत

Immunofluorescence Microscopy Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी

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Antibodies bind stably and specifically to their corresponding antigen, they are invaluable as probes for identifying a particular molecule in cells, tissues, or tissues, or biological fluids. Antibody molecules can be used to locate their target molecules accurately in single cells or in tissue sections by a variety of different labeling techniques. When the antibody itself, or the antiimmunoglobulin antibody used to detect it is labeled with a fluorescent dye the technique is known as immunoflurescence microscopy. As in all serological techniques, the antibody binds stably to its antigen, allowing unbound antibody to be removed by thorough washing. As antibodies to proteins recognize the surface features of the native, folded protein the native structure of the protein being sought usually needs to be preserved, either by using frozen tissue sections that are fixed only after the antibody reaction has been performed. Some antibodies, however, bind proteins even if they are denatured, and such antibodies will bind specifically even to protein in fixed tissue sections. एंटीबॉडी बाध्य करने के लिए विशेष stably और उनके इसी प्रतिजन , वे हैं अमूल्य की पहचान के रूप में जांच के लिए एक विशेष अणु में कोशिकाओं , ऊतक , या ऊतकों , जैविक या तरल . एंटीबॉडी अणु प्रयोग किया जा सकता है अपने लक्ष्य को खोजने में एक अणु ठीक ठीक कोशिकाओं या वर्गों में ऊतक लेबल के द्वारा विभिन्न प्रकार के विभिन्न तकनीकों . एंटीबॉडी जब स्वयं , या antiimmunoglobulin प्रतिपिण्ड का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है लेबल के साथ एक फ्लोरोसेंट रंजक तकनीक के रूप में जाना जाता है immunoflurescence माइक्रोस्कोपी . सीरम विज्ञानी के रूप में सभी तकनीकों के एंटीबॉडी बांधे stably अपने प्रतिजन , की अनुमति असीम एंटीबॉडी को हटाया जा द्वारा पूरी तरह से धोने . एंटीबॉडी करने के लिए प्रोटीन के रूप में पहचान की सतह की सुविधाओं का मूल निवासी है , मुड़े प्रोटीन के मूल ढाँचे के प्रोटीन की माँग की जा रही आमतौर पर संरक्षित करने की जरूरत है , या तो बंद का उपयोग करके ऊतक वर्गों के बाद ही निर्धारित हैं कि एंटीबॉडी प्रतिक्रिया प्रदर्शन किया गया है . एंटीबॉडी कुछ बहरहाल , भले ही वे बाध्य प्रोटीन विकृत कर रहे हैं , और ऐसे एंटीबॉडी भी विशेष रूप से बाध्य होंगे प्रोटीन ऊतक वर्गों में नियत है .

The fluorescent dye can be covalently attached directly to the specific antibody, but more commonly, the bound antibody is detected by fluorescent anti-immunoglobulin, a technique known as indirect immunofluorescence. The dyes chosen for immunofluroscence are exited by light of one wavelength, usually blue or green, and emit light of a different wavelength in the visible spectrum. The most common fluorescent dyes are fluorescein, which emitsgreen light, Texas Red and Peridinn chlorophyll protein (PerCP), which emit red light, and rhodamine and phycoerythrin (PE) which emit orange/red light. By using selective filters, only the light coming from the dye or flurochrome used is detected in the fluorescence microscope. This technique can be used to detect the distribution of any protein. By attaching different dyes to different antibodies, the distribution of two or more molecules can be determined in the same cell or tissue section. इस फ्लोरोसेंट रंजक संलग्न किया जा सकता है covalently सीधे के विशिष्ट प्रतिपिण्ड है , लेकिन आमतौर पर , बाध्य एंटीबॉडी द्वारा पता चला है फ्लोरोसेंट विरोधी immunoglobulin , एक अप्रत्यक्ष immunofluorescence तकनीक के नाम से जाना जाता है . रंजक के लिए चुना immunofluroscence हैं exited प्रकाश के द्वारा एक तरंगदैर्ध्य , आमतौर पर नीले रंग या हरे , और प्रकाश का उत्सर्जन में एक अलग तरंगदैर्ध्य स्पेक्ट्रम के दृश्य हैं . सबसे सामान्य फ्लोरोसेंट fluorescein रंजक होते हैं , जो प्रकाश emitsgreen , टेक्सास और Red Peridinn क्लोरोफिल प्रोटीन ( PerCP ) , जो उत्सर्जन लाल बत्ती , और rhodamine और phycoerythrin ( पीई ) जो नारंगी उत्सर्जन / लाल बत्ती . चयनात्मक फिल्टर का उपयोग करके , केवल से आने वाले प्रकाश की रंजक या flurochrome में प्रयोग किया जाता है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का पता चला है . इस तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता है पता लगाने के लिए प्रोटीन के वितरण के किसी भी है . रंजक को अलग अलग करके संलग्न एंटीबॉडी , वितरण के दो या अधिक अणुओं से निर्धारित किया जा सकता है उसी में कोशिका ऊतक या खंड है .

The recent development of the confocal fluorescent microscope, which uses computer-aided techniques to produce an ultrathin optical section of a cell or tissue, gives very high resolution immunofluorescence microscopy without the need for elaborate sample preparation. The resolution of the confocal microscope can be further increased using low-intensity illumination so that two photons are required to excite the flurochrome. A pulsed laser beam is used, and only when it is focused into the focal plane of the microscopeis the intensity sufficient to excite fluorescence. In this way the fluorescence emission itself can be restricted to the optical section. हाल के विकास के confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप , जो कम्प्यूटर का उपयोग करता है तकनीकों के उत्पादन के लिए सहायता प्राप्त ultrathin ऑप्टिकल विभाग के एक या एक कोशिका ऊतक , बहुत अधिक प्रस्ताव देता है immunofluorescence माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता के बिना तैयारी के लिए विस्तृत नमूना है . संकल्प के आगे किया जा सकता है confocal सूक्ष्मदर्शी तीव्रता कम रोशनी में वृद्धि का उपयोग कर दो ताकि फोटानों की flurochrome उत्तेजित करने के लिए आवश्यक हैं . स्पंदित एक लेजर बीम का प्रयोग किया जाता है , और केवल यह ध्यान में जब विमान के लैंस से उसके फोकस की तीव्रता microscopeis प्रतिदीप्ति उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त है . इस तरह के उत्सर्जन प्रतिदीप्ति स्वयं को सीमित किया जा सकता है ऑप्टिकल अनुभाग .

One important development in the area of microscopy has been the use of time-lapse video microscopy, in which sensitive digital video cameras record the movement of fluorescently labeled molecules in cell membranes and their redistribution when cells come into contact with each other. Cell-surface molecules can be fluorescently labeled in two main ways. One is by the binding of flurochrome-labeled Fab fragments of antibodies specific for the protein of intrest; the other is by generating a fusion protein, in which the protein of intrest has been attached to one of a family of florescent proteins obtained from jellyfish like GFP. The list of available fluorescent labels now includes red, blue, cyan or yellw fluorescent proteins. एक महत्वपूर्ण विकास के क्षेत्र में किया गया है माइक्रोस्कोपी के प्रयोग के समय व्यतीत हो माइक्रोस्कोपी वीडियो , जिसमें डिजिटल वीडियो कैमरों के प्रति संवेदनशील रिकॉर्ड की आवाजाही fluorescently लेबल अणुओं में झिल्लियों सेल और उनके पुनर्वितरण जब कोशिकाओं के साथ एक दूसरे के संपर्क में आए . सेल की सतह अणु की जा सकती है fluorescently लेबल में मुख्य रूप से दो तरह से है . द्वारा एक बाध्यकारी है flurochrome के लेबल के टुकड़ों के Fab एंटीबॉडी के लिए प्रोटीन के विशेष रुचि है , अन्य के द्वारा उत्पन्न एक संलयन प्रोटीन है , जिसमें प्रोटीन के हित से जुड़े एक कर दिया गया है फ्लोरोसेंट के परिवार के एक प्रोटीन से प्राप्त jellyfish जैसे GFP . की सूची में शामिल हैं उपलब्ध फ्लोरोसेंट लेबल अब लाल , नीले , हरिनील yellw या फ्लोरोसेंट प्रोटीन है .