Microscopia Di Immunofluorescenza

Impari Circa Microscopia Di Immunofluorescenza

Gli anticorpi si legano stabile e specificamente al loro antigene corrispondente, sono inestimabili come sonde per identificare una molecola particolare in cellule, tessuti, o tessuti, o liquidi biologici.  Le molecole dell'anticorpo possono essere usate per individuare esattamente le loro molecole dell'obiettivo in celluli o nelle sezioni del tessuto da una varietà di tecniche identificanti differenti.  Quando l'anticorpo in se, o l'anticorpo di antiimmunoglobulin usato per rilevarla è identificato con una tintura fluorescente la tecnica è conosciuta come microscopia di immunoflurescence.  Come in tutte le tecniche sierologiche, l'anticorpo si lega stabile al relativo antigene, permettendo che l'anticorpo non legato sia eliminato dal lavaggio completo.  Come gli anticorpi alle proteine riconoscono le caratteristiche di superficie del nativo, proteina piegata la struttura natale della proteina che è necessità solitamente cercate di essere conservato, uno usando le sezioni congelate del tessuto che sono fisse solo dopo che la reazione dell'anticorpo è stata effettuata.  Alcuni anticorpi, tuttavia, legano le proteine anche se sono denaturati e tali anticorpi legheranno specificamente anche a proteina nelle sezioni fisse del tessuto.

La tintura fluorescente può in covalenza essere fissata direttamente all'anticorpo specifico, ma più conunemente, l'anticorpo rilegato è rilevato dall'anti-immunoglobulina fluorescente, una tecnica conosciuta come l'immunofluorescenza indiretta.  Le tinture scelte per il immunofluroscence sono uscite da una luce di una lunghezza d'onda, solitamente blu o verde ed emettono la luce di una lunghezza d'onda differente nello spettro visibile.  Le tinture fluorescenti più comuni sono fluorescina, che emitsgreen la proteina della clorofilla della luce, di colore rosso del Texas e di Peridinn (PerCP), che emettono la luce rossa e rodamina e ficoeritrina (PE) che emettono la luce di orange/red.  Usando i filtri selettivi, soltanto la luce che viene dalla tintura o il flurochrome usato è rilevata nel microscopio di fluorescenza.  Questa tecnica può essere usata per rilevare la distribuzione di tutta la proteina.  Fissando le tinture differenti agli anticorpi differenti, la distribuzione di due o il più molecole possono essere determinati nella stessa cellula o sezione del tessuto.

Lo sviluppo recente del microscopio fluorescente confocal, che usa le tecniche assistite dall'elaboratore per produrre una sezione ottica ultrathin di una cellula o di un tessuto, dà la microscopia molto di alta risoluzione di immunofluorescenza senza l'esigenza della preparazione elaborata del campione.  La risoluzione del microscopio confocal può più ulteriormente essere aumentata usando l'illuminazione di basso-intensità in moda da richiedere due fotoni per eccitare il flurochrome.  Un fascio laser pulsato è usato e soltanto quando è messo a fuoco nel piano focale dei microscopeis l'intensità sufficiente per eccitare la fluorescenza.  In questo modo l'emissione in se di fluorescenza può limitarsi alla sezione ottica.

Uno sviluppo importante nella zona di microscopia è stato l'uso di video microscopia di tempo-intervallo, in cui le video macchine fotografiche digitali sensibili registrano il movimento delle molecole fluorescently identificate nelle membrane delle cellule e nella loro ridistribuzione quando le cellule gli entrano in contatto con.  le molecole della Cellula-superficie possono fluorescently essere identificate in due modi principali.  Uno è tramite il grippaggio dei frammenti flurochrome-identificati di Fab degli anticorpi specifici per la proteina di più intrest; l'altro è generando una proteina di fusione, in cui  la proteina di più intrest è stata fissata ad una di una famiglia delle proteine florescent ottenute dalle meduse come GFP.  La lista delle etichette fluorescenti disponibili ora include le proteine fluorescenti rosse, blu, ciane o del yellw.

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