Microscopia di immunofluorescenza

Impari circa microscopia di immunofluorescenza

Gli anticorpi legano stabile e specificamente al loro antigene corrispondente, sono inestimabili come sonde per l'identificazione della molecola particolare in celle, tessuti, o tessuti, o liquidi biologici. Le molecole dell'anticorpo possono essere usate per individuare esattamente le loro molecole dell'obiettivo in celluli o nelle sezioni del tessuto mediante varie tecniche di contrassegno differenti. Quando l'anticorpo in se, o l'anticorpo di antiimmunoglobulin usato per rilevarlo è contrassegnato con una tintura fluorescente la tecnica è conosciuta come microscopia di immunoflurescence. Come in tutte le tecniche sierologiche, l'anticorpo lega stabile al relativo antigene, permettendo che l'anticorpo non legato sia eliminato dal lavaggio completo. Come gli anticorpi alle proteine riconoscono le caratteristiche di superficie del nativo, proteina piegata la struttura natale della proteina che è necessità solitamente cercate di essere conservato, l'uno o l'altro usando le sezioni congelate del tessuto che sono fisse solo dopo che la reazione dell'anticorpo è stata effettuata. Alcuni anticorpi, tuttavia, legano le proteine anche se sono denaturati e tali anticorpi legheranno specificamente anche a proteina nelle sezioni fisse del tessuto.

La tintura fluorescente può in covalenza essere attaccata direttamente all'anticorpo specifico, ma più conunemente, l'anticorpo rilegato è rilevato dall'anti-immunoglobulina fluorescente, una tecnica conosciuta come l'immunofluorescenza indiretta. Le tinture scelte per il immunofluroscence sono uscite da un indicatore luminoso di una lunghezza d'onda, solitamente blu o verde ed emettono l'indicatore luminoso di una lunghezza d'onda differente nello spettro visibile. Le tinture fluorescenti più comuni sono fluorescina, che emitsgreen la proteina della clorofilla dell'indicatore luminoso, di colore rosso del Texas e di Peridinn (PerCP), che emettono la luce rossa e rodamina e ficoeritrina (PE) che emettono luce rossa arancione/. Usando i filtri selettivi, soltanto l'indicatore luminoso che viene dalla tintura o il flurochrome usato è rilevato nel microscopio di fluorescenza. Questa tecnica può essere usata per rilevare la distribuzione di tutta la proteina. Attaccando le tinture differenti agli anticorpi differenti, la distribuzione di due o più molecole può essere determinato nella stessa cella o sezione del tessuto.

Lo sviluppo recente del microscopio fluorescente confocal, che usa le tecniche assistite dall'elaboratore per produrre una sezione ottica ultrasottile di una cella o di un tessuto, dà la microscopia molto di alta risoluzione di immunofluorescenza senza l'esigenza della preparazione elaborata del campione. La risoluzione del microscopio confocal può ulteriormente essere aumentata usando l'illuminazione di basso-intensità in moda da richiedere due fotoni per eccitare il flurochrome. Un fascio laser pulsato è usato e soltanto quando è messo a fuoco nel piano focale dei microscopeis l'intensità sufficiente per eccitare la fluorescenza. In questo modo l'emissione in se di fluorescenza può limitarsi alla sezione ottica.

L'uno sviluppo importante nella zona di microscopia è stato l'uso di video microscopia di tempo-intervallo, in cui le videocamere digitali sensibili registrano il movimento delle molecole fluorescente contrassegnate nelle membrane delle cellule e nella loro ridistribuzione quando le celle gli entr inare contatto con. le molecole della Cella-superficie possono fluorescente essere contrassegnate in due modi principali. Uno è tramite il grippaggio dei frammenti favolosi flurochrome-contrassegnati degli anticorpi specifici per la proteina di interesse; l'altro è generando una proteina di fusione, in cui la proteina di interesse è stata attaccata ad uno di una famiglia delle proteine fluorescenti ottenute dalle meduse come GFP. La lista dei contrassegni fluorescenti disponibili ora include le proteine fluorescenti rosse, blu, ciano o del yellw.