Immunofluorescence Microscopy Technique and Theory Immunofluorescence Microscopy Teoria i technika

Immunofluorescence Microscopy Immunofluorescence Microscopy

Learn About Immunofluorescence Microscopy Dowiedz się więcej Immunofluorescence Microscopy

Antibodies bind stably and specifically to their corresponding antigen, they are invaluable as probes for identifying a particular molecule in cells, tissues, or tissues, or biological fluids. Antibody molecules can be used to locate their target molecules accurately in single cells or in tissue sections by a variety of different labeling techniques. When the antibody itself, or the antiimmunoglobulin antibody used to detect it is labeled with a fluorescent dye the technique is known as immunoflurescence microscopy. As in all serological techniques, the antibody binds stably to its antigen, allowing unbound antibody to be removed by thorough washing. As antibodies to proteins recognize the surface features of the native, folded protein the native structure of the protein being sought usually needs to be preserved, either by using frozen tissue sections that are fixed only after the antibody reaction has been performed. Some antibodies, however, bind proteins even if they are denatured, and such antibodies will bind specifically even to protein in fixed tissue sections. Przeciwciała wiążą stabilnie, a konkretnie do odpowiadających im antygenu, są nieocenione jako sondy do określenia w szczególności cząsteczki komórek, tkanek lub tkanek, płynów lub biologicznych. Przeciwciało cząsteczki mogą być używane do lokalizowania swoich docelowych cząsteczek dokładnie w jednym komórki lub tkanki w sekcjach przez różnych technik etykietowania. Kiedy się przeciwciała, lub antiimmunoglobulin używane do wykrywania przeciwciał jest etykietą z barwnikiem fluorescencyjnym technika znana jest jako immunoflurescence mikroskopu. podobnie jak we wszystkich technik serologicznych, przeciwciała wiąże się stabilnie na jego antygenu, co pozwala niezwiązanego przeciwciała, które mają być usunięte przez dokładne mycie. przeciwciał na białka powierzchniowe rozpoznaje cechy rodzimego, składany białka w rodzimej struktury białka są zwykle zgromadziła musi być zachowane, albo za pomocą zamrożonych tkanek sekcje, które są ustalone dopiero po przeciwciało Reakcja była wykonywana. Niektóre przeciwciała, jednak wiążące białka, nawet jeśli są one denaturowane, i takie przeciwciała wiążą się nawet specjalnie do białka w tkance stałych sekcjach.

The fluorescent dye can be covalently attached directly to the specific antibody, but more commonly, the bound antibody is detected by fluorescent anti-immunoglobulin, a technique known as indirect immunofluorescence. The dyes chosen for immunofluroscence are exited by light of one wavelength, usually blue or green, and emit light of a different wavelength in the visible spectrum. The most common fluorescent dyes are fluorescein, which emitsgreen light, Texas Red and Peridinn chlorophyll protein (PerCP), which emit red light, and rhodamine and phycoerythrin (PE) which emit orange/red light. By using selective filters, only the light coming from the dye or flurochrome used is detected in the fluorescence microscope. This technique can be used to detect the distribution of any protein. By attaching different dyes to different antibodies, the distribution of two or more molecules can be determined in the same cell or tissue section. W fluorescencyjnego barwnika mogą być związane kowalencyjnie dołączone bezpośrednio do specyficznych przeciwciał, ale bardziej ogólnie, związana jest wykrywane przez przeciwciało anty-fluorescencyjny immunoglobuliny, technika znana jako pośredniej immunofluorescencji. Wybranych barwników do immunofluroscence są wyjść przez świetle jednej długości fali, zwykle niebieskie lub zielony, i emitują światło o innej długości fali w spektrum widzialnym. Najczęstszą barwników fluorescencyjnych są fluoresceiny, który emitsgreen świetle, Texas Red Peridinn chlorofil i białko (PerCP), które emitują światło czerwone, rhodamine i fikoerytryna (PE) emituje pomarańczowe / czerwone światło. Poprzez selektywne przy użyciu filtrów, tylko światło pochodzące z barwnika lub flurochrome używane jest wykryta w Mikroskop fluorescencyjny. Ta technika może być używana do wykrywania dystrybucji jakichkolwiek białek. dołączając do różnych barwników różnych przeciwciał, dystrybucji dwóch lub więcej cząsteczek może zostać określona w tej samej komórki lub tkanki.

The recent development of the confocal fluorescent microscope, which uses computer-aided techniques to produce an ultrathin optical section of a cell or tissue, gives very high resolution immunofluorescence microscopy without the need for elaborate sample preparation. The resolution of the confocal microscope can be further increased using low-intensity illumination so that two photons are required to excite the flurochrome. A pulsed laser beam is used, and only when it is focused into the focal plane of the microscopeis the intensity sufficient to excite fluorescence. In this way the fluorescence emission itself can be restricted to the optical section. Niedawny rozwój w confocal mikroskopu fluorescencyjnego, która korzysta z technik wspomaganego komputerowo do produkcji ultrathin optyczne sekcji komórki lub tkanki, daje bardzo wysokiej rozdzielczości mikroskopu immunofluorescencyjnego bez konieczności opracowania przygotowania próbki. Rezolucji z confocal microscope może być dalej zwiększona za pomocą niskiej intensywności oświetlenia tak, że dwa fotony są zobowiązani do usunięcia z flurochrome. impulsowe wiązki laserowej jest używany, i tylko wtedy, gdy jest on skoncentrowany w płaszczyźnie ogniskowej z microscopeis intensywności fluorescencji wystarczające do usunięcia. W ten sposób emisji fluorescencji może być ograniczone do części optycznych.

One important development in the area of microscopy has been the use of time-lapse video microscopy, in which sensitive digital video cameras record the movement of fluorescently labeled molecules in cell membranes and their redistribution when cells come into contact with each other. Cell-surface molecules can be fluorescently labeled in two main ways. One is by the binding of flurochrome-labeled Fab fragments of antibodies specific for the protein of intrest; the other is by generating a fusion protein, in which the protein of intrest has been attached to one of a family of florescent proteins obtained from jellyfish like GFP. The list of available fluorescent labels now includes red, blue, cyan or yellw fluorescent proteins. Jednym z ważniejszych rozwoju w dziedzinie mikroskopii został korzystania z time-lapse Video Microscopy, w których wrażliwe cyfrowych kamer wideo rejestrują ruch cząsteczek fluorescencyjne, oznaczone w błony komórkowe i ich redystrybucji, gdy komórki stykają się ze sobą. Powierzchni komórki cząsteczek fluorescencyjne mogą być oznaczone na dwa główne sposoby. Jednym z nich jest przez wiązanie flurochrome-oznaczone fragmenty Fab przeciwciała specyficzne dla białka interesów; drugiej jest wygenerowanie syntezy białka, w którym białka zainteresowania został załączony do jednego z rodziny fluorescencyjny białek uzyskanych z Jellyfish jak zwykłej dobrej praktyki rolniczej. listę dostępnych obecnie obejmuje etykiety fluorescencyjny czerwony, niebieski, błękitny lub yellw fluorescencyjny białek.