Microscopia da imunofluorescência

Aprenda sobre a microscopia da imunofluorescência

Os anticorpos ligam estàvel e especificamente a seu antígeno correspondente, são inestimáveis como pontas de prova para identificar uma molécula particular nas pilhas, os tecidos, ou os tecidos, ou líquidos biológicos.  As moléculas do anticorpo podem ser usadas para encontrar exatamente suas moléculas do alvo em únicas pilhas ou em seções do tecido por uma variedade de técnicas de rotulagem diferentes.  Quando o anticorpo próprio, ou o anticorpo do antiimmunoglobulin usado para o detectar são etiquetados com uma tintura fluorescente a técnica está sabida como a microscopia do immunoflurescence.  Como em todas as técnicas serological, o anticorpo liga estàvel a seu antígeno, permitindo que o anticorpo unbound seja removido pela lavagem completa.  Como os anticorpos às proteínas reconhecem as características de superfície do nativo, proteína dobrada a estrutura nativa da proteína que é necessidades geralmente procuradas de ser preservado, qualquer um usando as seções congeladas do tecido que são fixas somente depois que a reação do anticorpo foi executada.  Alguns anticorpos, entretanto, ligam proteínas mesmo se são desnaturados, e tais anticorpos ligarão especificamente mesmo à proteína em seções fixas do tecido.

A tintura fluorescente pode covalently ser anexada diretamente ao anticorpo específico, mas mais geralmente, o anticorpo encadernado é detectado pela anti-imunoglobulina fluorescente, uma técnica conhecida como a imunofluorescência indireta.  As tinturas escolhidas para o immunofluroscence são retiradas por uma luz de um comprimento de onda, geralmente azul ou verde, e emitem-se a luz de um comprimento de onda diferente no espectro visível.  As tinturas fluorescentes as mais comuns são fluoresceína, que emitsgreen a proteína da clorofila da luz, do vermelho de Texas e do Peridinn (PerCP), que se emitem a luz vermelha, e rhodamine e phycoerythrin (PE) que se emitem luz alaranjada/vermelha.  Usando filtros seletivos, somente a luz que vêm da tintura ou o flurochrome usado são detectados no microscópio de fluorescência.  Esta técnica pode ser usada para detectar a distribuição de toda a proteína.  Anexando tinturas diferentes aos anticorpos diferentes, a distribuição de dois ou mais moléculas pode ser determinado na mesma pilha ou seção do tecido.

O desenvolvimento recente do microscópio fluorescente confocal, que usa técnicas assistidas por computador para produzir uma seção ótica ultrathin de uma pilha ou de um tecido, dá a microscopia muito de alta resolução da imunofluorescência sem a necessidade para a preparação elaborada da amostra.  A definição do microscópio confocal pode mais ser aumentada usando a iluminação da baixo-intensidade de modo que dois fotão sejam exigidos para excitar o flurochrome.  Um raio laser pulsado está usado, e somente quando é focalizado no plano focal dos microscopeis a intensidade suficiente para excitar a fluorescência.  Desta maneira a emissão própria da fluorescência pode ser restringida à seção ótica.

Um desenvolvimento importante na área da microscopia foi o uso da microscopia video do tempo-lapso, em que as câmaras de vídeo digitais sensíveis gravam o movimento de moléculas fluorescente etiquetadas nas membranas de pilha e na sua redistribução quando as pilhas entram o contato um com o otro.  as moléculas da Pilha-superfície podem fluorescente ser etiquetadas em duas maneiras principais.  Um é pelo emperramento de fragmentos fabulosos flurochrome-etiquetados dos anticorpos específicos para a proteína do interesse; o outro é gerando uma proteína da fusão, em que a proteína do interesse foi anexada a uma de uma família das proteínas fluorescentes obtidas das medusa como GFP.  A lista de etiquetas fluorescentes disponíveis inclui agora proteínas fluorescentes vermelhas, azuis, cianas ou do yellw.

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