ELISA Radioimmunoassay Technique and Theory ELISA Radioimmunoassay Teknik och Teori

ELISA Radioimmunoassays ELISA Radioimmunoassays

Radioimmunoassay (RIA), and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and competitive inhibition assay. Radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive inhibition assay.

Radioimmunoassay (RIA) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) are direct binding assays for antibody or antigen and both work on the same principle, but the means of detecting specific binding is different. Radioimmunoassays are commonly used to measure the levels of hormones in blood and tissue fluids, while ELISA assays are frequently used in viral diagnostics. For both these methods one needs a pure preparation of a known antigen or antibody, or both, in order to standardize the assay. This assay will be described with a sample of pure antibody, but the principle is similar if pure antigen is used instead. In RIA for an antigen, pure antibody against that antigen is radioactively labeled, usually with 125I; for the ELISA, an enzyme is linked chemically to the antibody. The unlabeled component, which in this case would be antigen, is attached to a solid support, such as the wells of a plastic multiwell plate, which will absorb a certain amount of any protein. Radioimmunoassay (RIA) och enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) är direkt bindande analyser avseende antikroppar eller antigen och båda arbetar på samma princip, men de instrument för att upptäcka specifika bindande är annorlunda. Radioimmunoassays allmänt används för att mäta nivåerna av hormoner i Blod och vävnadsvätskor, medan ELISA-test används ofta i viral diagnostik. För båda dessa metoder behöver man en ren förberedelse av en känd antigen eller antikropp, eller båda, i syfte att standardisera de analysen. Bioassayn kommer att beskrivas med ett urval av ren antikropp, men principen är liknande om rena antigen används i stället. RIA för ett antigen, rena antikroppar mot det antigen är radioaktivt märkta, oftast med 125I; för ELISA, ett enzym som är kopplat kemiskt till antikroppen. omärkta komponent , Som i detta fall skulle vara antigen, är knutna till ett fast stöd, till exempel brunnar i plast multispot plattan, som kommer att absorbera en viss mängd av något protein.

The labeled antibody is allowed to bind to the unlabeled antigen, under conditions where nonspecific absorption is blocked, and any unbound antibody and other proteins are washed away. Den heter antikropp får binda till de omärkta antigen, under förhållanden där nonspecific absorption är blockerade, och varje obundna antikroppar och andra proteiner har spolats bort.

Antibody binding to RIA is measured directly in terms of the amount of radioactivity retained by the coated wells, whereas in Elisa, binding is detected by a reaction that converts a colorless substrate into a colored reaction product. The color change can be read directly in the reaction tray, making data collection very easy, and ELISA also avoids the hazards of radioactivity. This makes ELISA the preferred method for more direct binding assays. Antikroppen binder till RIA mäts direkt i termer av mängden radioaktivitet uppges av de belagda brunnarna, medan det i Elisa, bindande påvisas genom en reaktion som omvandlar en färglös substrat i en färgad reaktionsprodukt. Färgen förändras kan läsas direkt i reaktion plattan, vilket gör datainsamling mycket lätt, och ELISA undviks också riskerna med radioaktivitet. Detta gör ELISA att föredra för att mer direkt bindande analyser.

Labeled anti-immunoglobulin anti-bodies can also be used in RIA or ELISA to detect binding of unlabeled antibody to unlabeled antigen-coated plates. In this case, the labeled anti-immunoglobulin antibody is used in what is termed a ‘second layer’. The use of a second layer also amplifies the signal, as at least two molecules of the labeled anti-immunoglobin antibody are able to bind to each unlabeled antibody. RIA and ELISA can also be carried out with unlabelled antibody stuck on the plates and labeled antigen added. Märkning anti-immunoglobulin anti-organ kan också användas i RIA eller ELISA för att påvisa bindning av omärkta antikropp mot omärkta antigen-lackerad plåt. I detta fall har märkt anti-immunoglobulin antikropp används i vad som kallas en "andra lagret". Användningen av ett andra lager också förstärker signalen, som minst två molekyler i den som heter anti-immunoglobin antikroppen kan binda till var omärkta antikropp. RIA och ELISA kan också utföras med omärkta antikropp fastnar på plattorna och märkt antigen läggas.

Figure: The principle of the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) Figur: Principen om enzymet immunosorbent assay (ELISA)

elisa

To detect antigen A, purified antibody specific for antigen A is linked chemically to an enzyme. The samples to be tested are coated onto the surface of plastic wells to which they bind nonspecifically. Att påvisa antigen A, renade antikroppar specifika för antigen A hänger kemiskt till ett enzym. Prover som skall testas är belagda på ytan av plast brunnar som de binder nonspecifically. Residual sticky sites on the plastic are blocked by adding irrelevant proteins (not shown). The labeled antibody is then added to the wells under conditions where non specific binding Återstodsoljor klibbiga webbplatser på plast är blockerade genom att lägga irrelevanta proteiner (visas inte). Märkt antikropp är sedan läggas till de brunnar under förhållanden där icke specifik bindning